Projekte

Diese Seite gibt eine kurze Einführung in die verschiedenen Forschungsprojekte der Projektgruppe "Functional Genomics-Analysen der Morphogenese von Pilzen". Detaillierte Informationen hierzu gibt es in mehreren Veröffentlichungen. Interessierte Studierende können im Rahmen von S-Modulen am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik an aktuellen Forschungsthemen mitarbeiten. Diese vier- oder sechs-wöchigen Laborpraktika können zu Bachelor- oder Masterarbeitsprojekten hinführen.

Vielzellige Entwicklung, wie z.B. die Entwicklung von Pilzfruchtkörpern, kann nur korrekt ablaufen, wenn viele Gene koordiniert exprimiert werden. Die Gene müssen zur richtigen Zeit und am richtigen Ort (d.h. in den richtigen Zellen des Organismus) aktiviert oder deaktiviert werden, um einen funktionellen Fruchtkörper zu ergeben. Auch Signale von Außen, wie z.B. Temperatur, Feuchtigkeit, Nährstoffangebot und viele andere müssen berücksichtigt werden. Während der letzten Jahre wurden Methoden wie Mikroarrays und RNA-Seq entwickelt, mit denen die Expression von hunderten oder tausenden von Genen gleichzeitig untersucht werden kann. Im Moment arbeiten wir an Projekten zur Analyse der differentiellen Genexpression bei verschiedenen Hyphenpilzen sowie an "comparative genomics"-Projekten. Untersuchungen wie diese liefern Informationen darüber, wie ein Pilzgenom vielzellige Entwicklung kontrolliert.

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Sordaria macrospora ist ein filamentöser Ascomycet, der bereits seit einigen Jahrzehnten als Modellorganismus für entwicklungsbiologische Fragestellungen sowie für die Grundlagen der Meiose (der sexuellen Vermehrung der Eukaryoten) dient. Um einen tieferen Einblick in die Biologie dieses Pilzes zu erhalten, haben wir in Zusammenarbeit mit Forschergruppen aus vier verschiedenen Ländern nun das Genom von S. macrospora sequenziert.

Genomsequenzierungen waren bis vor kurzem extrem teuer und aufwendig und daher meist spezialisierten Sequenzierungs- und Bioinformatik-Instituten vorbehalten. Vor einigen Jahren wurden aber neue Sequenziertechniken, sogenannte "Next-Generation"-Techniken entwickelt, die im Hochdurchsatzverfahren wesentlich kostengünstiger sind. Am Beispiel von S. macrospora konnten wir zeigen, dass die "Next-Generation"-Sequenziertechniken effizient genutzt werden können, um Genome komplexer Organismen wie Pilze zu sequenzieren. Ausserdem lieferten die Genomdaten wertvolle Erkenntnisse zur Lebensweise und Evolution von Pilzen.

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Hier klicken zum Genombrowser und hier zum Herunterladen von Sequenzen und der Publikation des Genoms.

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Das Genom wurde aus ca. 96 Millionen Einzelsequenzen ("reads", ca. 95 Mio. paired-end 36 nt Solexa-reads und 1 Mio. 454 reads) zusammengesetzt. In einer kürzlich durchgeführten Folgestudie haben wir die Genomsequenz durch das Zusammensetzen von Contigs weiter verbessert, und ausserdem UTRs (nicht-translatierte Regionen) für > 50 % der vorhergesagten Gene modelliert. Die Daten sind als Genom-Version 02 öffentlich zugänglich (hier klicken). Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über einige wesentliche Eigenschaften des Genoms von S. macrospora.

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Für mehrere Hauptgruppen der Ascomyceten (Sordariomycetes, Leotiomycetes, Eurotiomycetes, and Dothideomycetes) stehen bereits Genomsequenzen zur Verfügung, aber für die Pezizomyceten gibt es bisher nur eine Genomsequenz (Trüffel). Die Pezizomyceten sind eine basale Gruppe der filamentösen Ascomyceten, und die Untersuchung eines weiteren Pezizomyceten-Genoms erlaubt daher Schlußfolgerungen über die Evolution der Ascomyceten von einfacheren zu komplexeren morphologischen Formen. P. confluens gehört zu den Pezizomyceten und bildet einem typischen, einfach gebauten Fruchtkörper (Apothecium, siehe Bild unten). Der Pilz wurde bereits in der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts zur Analyse der Fruchtkörperentwicklung bei Ascomyceten verwendet. Im Rahmen des DFG-geförderten Projekts soll das P. confluens-Genom mittels "Next-Generation"-Techniken (Roche/454 und Illumina/Solexa) sequenziert werden. Zusätzlich sollen cDNAs aus verschiedenen Entwicklungsstadien und Wachstumsbedingungen mittels Solexa-Technik (RNA-Seq) sequenziert werden, denn Transkriptom-Daten ermöglichen eine wesentlich bessere Annotation als Genomdaten allein. Die Genomsequenz sowie die vorhergesagten Gene und Transkripte sollen dann mit denjenigen anderer Pilze verglichen werden. Durch diesen Ansatz können neue Erkenntnisse zur Evolution von Genfamilien und Genexpression sowie zur Genomstruktur bei filamentösen Ascomyceten gewonnen werden.

Das Bild zeigt den Lebenszyklus von Pyronema confluens. Er beginnt mit einer Ascospore, die auskeimt und ein Myzel bildet. Nach mehreren Tagen unter Nährstoff- Mangel werden männliche und weibliche Strukturen (Antheridien und Ascogone) gebildet, die über eine Trichogyne fusionieren. Nach der Zellfusion wandern Kerne vom Antheridium ins Ascogon, was daraufhin ascogene Hyphen bildet, die wiederum Asci hervorbringen. Die Asci sind die typischen Sporangien der Ascomyceten, in ihnen finden Karyogamie und Meiose statt. Dies führt bei P. confluenszur Bildung von acht Ascosporen, die ausgeschleudert werden und den Zyklus von neuem beginnen. Im Unterschied zu den Sordariomyceten bildet P. confluens (der zu den Pezizomyceten gehört) keine geschlossenen Perithezien als Fruchtkörper (für ein Beispiel eines Peritheziums, siehe nächsten Abschnitt), sondern sogenannte Apothezien. Dabei handelt es sich um einen ursprünglichen Fruchtkörpertyp, bei dem die Asci ungeschützt an der Oberfläche liegen.

Sordaria macrospora ist ein Hyphenpilz, der sehr nahe mit Neurospora crassa verwandt ist. Aber im Gegensatz zu Neurospora ist Sordaria homothallisch, was bedeutet, dass ein einzelner Stamm Fruchtkörper (Perithezien) bilden kann, ohne dafür einen Partner von entgegengesetztem Kreuzungstyp zu benötigen. Der Entwicklungszyklus von S. macrospora ist links abgebildet. Er beginnt mit einer Ascospore, die auskeimt und zu einem Myzel auswächst. Innerhalb von einer Woche werden Perithezien gebildet, in denen Asci produziert werden, die jeweils acht Ascosporen enthalten. Die Ascosporen werden aus dem Fruchtkörper ausgeschleudert und der Zyklus beginnt von Neuem.

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Bei mehreren Sordaria-Mutanten ist der Entwicklungszyklus an einem bestimmten Punkt unterbrochen, so dass keine reifen Sporen mehr gebildet werden. Einige dieser Mutanten bilden nur sogenannte Vorfruchtkörper (Protoperithezien), daher werden sie pro-Mutanten genannt. Die Analyse der Genexpression in diesen pro-Mutanten wird weiter unten beschrieben. Eine andere Mutante, die Fruchtkörper aber keine reifen Sporen bildet, heißt per5. Das Gen, das in der Mutante per5 defekt ist, kodiert für eine Untereinheit der ATP-Citrat-Lyase. Dieses Enzym ist an der Produktion von Acetyl-CoA beteiligt, einem Molekül, das für die Fettsäurebiosynthese gebraucht wird.

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Die drei Gene pro1, pro11 und pro22 kodieren für einen Transkriptionsfaktor bzw. zwei putative regulatorische Proteine. Mutanten in diesen drei Genen sehen sich sehr ähnlich, daher stellte sich die Frage, ob die drei pro-Gene ähnliche Signaltransduktionswege etc. regulieren. Um diese Frage zu beantworten, haben wir Mikroarray-Analysen durchgeführt, um die Genexpression in den Mutanten mit der des Wildtyps zu vergleichen. Die Analysen zeigten, dass es tatsächlich überlappende Genexpressionsmuster in den drei Mutanten gibt. Ausserdem sind einige der differentiell exprimierten Gene selbst an der Fruchtkörperbildung beteiligt.

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Eine weitere Mutante mit einem Block in der Fruchtkörper-Entwicklung im Stadium der Protoperithezien-Bildung ist die Mutante pro41. Das pro41-Gen kodiert für ein bislang unbekanntes Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das spezifisch für filamentöse Ascomyceten ist. Die Expression von pro41 hängt vom Transkriptionsfaktor-Gen pro1 ab, und wir konnten durch Mikroarray-Analysen zeigen, dass pro41 im Verlaufe der Fruchtkörper-Differenzierung wahrscheinlich stromabwärts von pro1 agiert.

Dieses Bild soll einen Eindruck davon vermitteln, wie die Ergebnisse einer Mikroarray-Analyse aussehen können. Die Abbildung zeigt eine sogenannten Cluster-Analyse von Mikroarray-Daten. Jede Zeile repräsentiert ein Gen, das rechts mit einer Nummer gekennzeichnet ist. Jede Spalte repräsentiert ein einzelnes Mikroarray-Experiment, in dem die Expression einer Mutante, z.B. pro1, mit dem Wildtyp verglichen wurde. Jedes der farbigen Rechtecke zeigt daher die Expression eines bestimmten Gens in einer Mutante im Vergleich zum Wildtyp in einem bestimmten Experiment. Grün bedeutet, dass das Gen in der Mutante herunterreguliert ist, rot bedeutet, dass das Gen in der Mutante stärker exprimiert wird als im Wildtyp. In diesem Bild sind nur Gene gezeigt, die in allen Mutanten im Rahmen dieser Untersuchung herauf- oder herunterreguliert waren. Eine vollständige Analyse von Array-Daten zeigt viel mehr Gene mit komplexen Expressionsmustern, z.B. Gene, die nur in einer oder zwei Mutanten herauf- oder herabreguliert sind.

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Zur Zeit arbeiten wir an weiteren Expressionsanalysen, bei denen wir eine Kombination aus Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) und RNA-Seq einsetzen. Mit LCM können wir junge Fruchtkörper vom umgebenden Myzel trennen. Wir können dann RNA aus diesen Protoperithezien isolieren und sie für RNA-Seq einsetzen. Diese neue Technik verwendet Next-Generation-Sequenziermethoden (hier: Illumina/Solexa-Sequenzierung), um eine sehr große Sequenziertiefe zu erreichen, mit der auch schwach exprimierte Gene detektiert werden können. Durch die Kombination von LCM und RNA-Seq ist es uns zum ersten Mal gelungen, eine genomweite räumliche Verteilung der Genexpression während der Fruchtkörperentwicklung von S. macrospora zu untersuchen.

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Die Fruchtkörper von filamentösen Ascomyceten wie S. macrospora, N. crassa und P. confluens sind homologe Strukturen, d.h. sie sind aus einem gemeinsamen Vorfahr entstanden. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Genexpressionsmuster, die für der Fruchtkörperentwicklung nötig sind, ebenfalls zu einem gewissen Grad konserviert sind. Um mehr darüber zu erfahren, welche Gene während der Fruchtkörperentwicklung in verschiedenen Pilz-Spezies exprimiert werden, haben wir ein Projekt begonnen, bei dem die Genexpression in den Hyphenpilzen P. confluens und S. macrospora verglichen wird. P. confluens gehört zu einer ursprünglichen Gruppe von Ascomyceten und bildet einen eher einfachen Fruchtkörper, der als Apothezium bezeichnet wird, wohingegen S. macrospora zu einer abgeleiteten Ascomycetengruppe gehört und einen komplexeren Fruchtkörpertyp (Perithezium) bildet. Ein Vergleich der Genexpression zwischen diesen beiden Arten kann daher dazu beitragen, Gene zu identifizieren, deren Expressionsmuster im Verlauf der Fruchtkörperevolution erhalten geblieben sind.

Dieses Bild zeigt das Ergebnis eines ersten Vergleichs der Genexpression für neun Gene (gekennzeichnet durch die jeweilige Nummer in jeder Zeile) von P. confluens (P.c.) und S. macrospora (S.m.). Für jedes Gen wurde das Verhältnis der Expression während der Fruchtkörperdifferenzierung im Vergleich zum vegetativen Wachstum mit Hilfe der quantitativen Real-Time-PCR ermittelt. Die Ergebnisse sind als logarithmische Werte angegeben, d.h. positive Werte (rot) zeigen an, dass ein Gen während der Entwicklung heraufreguliert ist, negative Werte (grün), dass es herunterreguliert ist. Werte zwischen -1 und +1 (grau) zeigen an, dass das Gen nicht differentiell exprimiert ist. Von den neun Genen sind drei in beiden Arten heraufreguliert und drei in beiden Arten nicht differentiell exprimiert. Dies zeigt an, dass die Genexpression während der Fruchtkörperentwicklung sogar in diesen beiden nicht sehr nah verwandten Pilzen zu einem hohen Grad konserviert ist.

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Abgesehen von evolutionär konservierten Genexpressionmustern ist das sogenannten "Clustering", d.h. die Anordnung von Genen direkt nebeneinander im Genom und ihre gemeinsame Regulation, ein weiteres wichtiges Kriterium, mit dem man bei Pilzen Gene identifizieren kann, die möglicherweise funktionelle Bedeutung haben. In Pilzen kodieren solche Gene oft für Enzyme des sogenannten Sekundärstoffwechsels, bei dem verschiedenste Substanzen produziert werden, die oft pharmakologisch relevante Wirkung zeigen. Zu den Sekundärmetaboliten gehören u.a. das Antibiotikum Penicillin, aber auch Gifte wie das Mykotoxin Aflatoxin. Genomprojekte haben gezeigt, dass Pilze meist eine große Anzahl von Genclustern für Sekundärmetaboliten enthalten, aber die Funktion der möglicherweise produzierten Stoffe ist größtenteils noch völlig unbekannt. Eine Möglichkeit ist, dass Sekundärmetabolite unter bestimmten Bedingungen oder während bestimmter Lebensstadien für den Pilz nützlich sind, so z.B. während der sexuellen Entwicklung. Daher haben wir eine "comparative functional genomics"-Analyse durchgeführt, bei der wir speziell nach Genen gesucht haben, die nicht nur während der sexuellen Entwicklung in S. macrospora und N. crassa hochreguliert sind, sondern die weiterhin auch physikalisch geclustert in den jeweiligen Genomen vorliegen.

Das Bild zeigt einen solchen Cluster mit der Genomorganisation in S. macrospora (S.m.) und N. crassa (N.c.). Die Gene sind durch Pfeile repräsentiert, die Farbe zeigt an, ob das Gen während der sexuellen Entwicklung hochreguliert ist (rot) oder nicht (schwarz oder grau). Genregionen, die durch graue Schattierung zwischen den beiden Spezies markiert sind, sind ähnlich. Dies zeigt, dass nicht nur die Genexpressionsmuster, sondern auch die Anordnung der Gene im Genom zum größten Teil konserviert ist. Es konnte in einer genaueren Analyse gezeigt werden, dass eines der Gene (2925) an der Fruchtkörperbildung beteiligt ist, da die Deletion dieses Gen zu verzögerter Fruchtkörperreifung führt.

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In den vorigen Projekten wurde die Genexpression auf Transkriptebene mit Hilfe von Mikroarrays und Real-Time-PCR untersucht. Genexpression kann allerdings noch auf vielen weiteren Ebenen reguliert werden, und auch diese können während der pilzlichen Entwicklung konserviert sein, wie die Analyse eines Fruchtkörper-spezifischen Proteins aus S. macrospora und N. crassa zeigte. Das Protein wurde entdeckt, weil es in diesen beiden Ascomyceten sehr stark in Fruchtkörpern angereichert wird, daher wurde es APP für "abundant perithecial protein" genannt.

Dieses Bild zeigt, dass das APP-Protein sowohl in S. macrospora als auch in N. crassa nur in Fruchtkörpern und nicht im umgebenden Myzel angereichert wird. Der obere Teil zeigt die mikroskopische Analyse eines Fusionsproteins, das aus APP und dem grün-fluoreszierenden Protein (GFP) besteht. Das Fusionskonstrukt wurde unter der Kontrolle der regulatorischen Regionen von app exprimiert. Das linke Bild zeigt ein einen jungen Fruchtkörper (Protoperithezium) mit umgebenden Hyphen im differentiellen Interferenzkontrast (DIC). Die grüne GFP-Fluoreszenz kann im jungen Fruchtkörper beobachtet werden, nicht aber in den umgebenden Hyphen. Im unteren Teil ist die Analyse des nativen APP aus N. crassa zu sehen. Proteinextrakte aus Fruchtkörpern und dem umgebenden Myzel (total) sowie aus Fruchtkörpern allein (perithecia) bzw. dem umgebenden Myzel allein (mycelium) wurden nach 10, 12 oder 14 Tagen extrahiert und auf einem denaturierenden Proteingel aufgetrennt. Die APP-Bande ist durch einen Pfeil markiert. APP ist im Gesamtextrakt (total) und in den Fruchtkörpern zu sehen, aber nicht im umgebenden Myzel. Diese und andere Analysen zeigen, dass die Expression von app in S. macrospora und N. crassa sowohl zeitlich als auch räumlich konserviert ist. Eines unserer weiteren Ziele ist es herauszufinden, in welchem Grad die Genexpression während der pilzlichen Entwicklung auf verschiedenen regulatorischen Ebenen konserviert ist.