Functional Genomics-Analysen der Morphogenese bei Pilzen: Projekte

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Diese Seite gibt eine kurze Einführung in die verschiedenen Forschungsprojekte der Projektgruppe "Functional Genomics-Analysen der Morphogenese von Pilzen". Detaillierte Informationen hierzu gibt es in mehreren Veröffentlichungen. Interessierte Studierende können im Rahmen von S-Modulen am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik an aktuellen Forschungsthemen mitarbeiten. Diese vier- oder sechs-wöchigen Laborpraktika können zu Bachelor- oder Masterarbeitsprojekten hinführen.

Vielzellige Entwicklung, wie z.B. die Entwicklung von Pilzfruchtkörpern, kann nur korrekt ablaufen, wenn viele Gene koordiniert exprimiert werden. Die Gene müssen zur richtigen Zeit und am richtigen Ort (d.h. in den richtigen Zellen des Organismus) aktiviert oder deaktiviert werden, um einen funktionellen Fruchtkörper zu ergeben. Auch Signale von Außen, wie z.B. Temperatur, Feuchtigkeit, Nährstoffangebot und viele andere müssen berücksichtigt werden. Während der letzten Jahre wurden Methoden wie Mikroarrays und RNA-Seq entwickelt, mit denen die Expression von hunderten oder tausenden von Genen gleichzeitig untersucht werden kann. Im Moment arbeiten wir an Projekten zur Analyse der differentiellen Genexpression bei verschiedenen Hyphenpilzen sowie an "comparative genomics"-Projekten. Untersuchungen wie diese liefern Informationen darüber, wie ein Pilzgenom vielzellige Entwicklung kontrolliert.

1. Sequenzierung des Genoms von Sordaria macrospora mit "Next-Generation"-Sequenziertechniken

Genomgröße 39.8 Mb
Chromosomen 7
Scaffolds 1583
Proteinkodierende Gene 10789
Durchschnittliche CDS-Länge (min/max) 1423 bp (54 bp / 33321 bp)
tRNA-Gene 455
% kodierende Sequenzen 38.4


2. Sequenzierung des Pyronema confluens-Genoms mit "Next-Generation"-Sequenziertechniken

Genomgröße 50 Mb
Scaffolds 1588
Scaffold N50 135 kb
Proteinkodierende Gene 13369
Durchschnittliche CDS-Länge 1093 nt
Durchschnittliche mRNA-Länge 1483 nt
tRNA-Gene 605
% kodierende Sequenzen 29.2
Größe der mtDNA 191 kb


3. "Functional genomics"-Analysen der Fruchtkörperentwicklung bei dem Hyphenpilz Sordaria macrospora

Sordaria life cycle

Sordaria macrospora ist ein Hyphenpilz, der sehr nahe mit Neurospora crassa verwandt ist. Aber im Gegensatz zu Neurospora ist Sordaria homothallisch, was bedeutet, dass ein einzelner Stamm Fruchtkörper (Perithezien) bilden kann, ohne dafür einen Partner von entgegengesetztem Kreuzungstyp zu benötigen. Der Entwicklungszyklus von S. macrospora ist links abgebildet. Er beginnt mit einer Ascospore, die auskeimt und zu einem Myzel auswächst. Innerhalb von einer Woche werden Perithezien gebildet, in denen Asci produziert werden, die jeweils acht Ascosporen enthalten. Die Ascosporen werden aus dem Fruchtkörper ausgeschleudert und der Zyklus beginnt von Neuem.



cross-species microarrays

Dieses Bild soll einen Eindruck davon vermitteln, wie die Ergebnisse einer Mikroarray-Analyse aussehen können. Die Abbildung zeigt eine sogenannten Cluster-Analyse von Mikroarray-Daten. Jede Zeile repräsentiert ein Gen, das rechts mit einer Nummer gekennzeichnet ist. Jede Spalte repräsentiert ein einzelnes Mikroarray-Experiment, in dem die Expression einer Mutante, z.B. pro1, mit dem Wildtyp verglichen wurde. Jedes der farbigen Rechtecke zeigt daher die Expression eines bestimmten Gens in einer Mutante im Vergleich zum Wildtyp in einem bestimmten Experiment. Grün bedeutet, dass das Gen in der Mutante herunterreguliert ist, rot bedeutet, dass das Gen in der Mutante stärker exprimiert wird als im Wildtyp. In diesem Bild sind nur Gene gezeigt, die in allen Mutanten im Rahmen dieser Untersuchung herauf- oder herunterreguliert waren. Eine vollständige Analyse von Array-Daten zeigt viel mehr Gene mit komplexen Expressionsmustern, z.B. Gene, die nur in einer oder zwei Mutanten herauf- oder herabreguliert sind.



Venn diagram

Das Bild zeigt ein sogenanntes Venn-Diagramm, das die Zahl der Gene zeigt, die unter einer oder mehreren getesteten Bedingungen unter den 500 am stärksten exprimierten Genen sind.





4. Vergleichende Genexpressionsanalysen ("comparative functional genomics") mit Sordaria macrospora, Neurospora crassa und Pyronema confluens

comparative expression analysis

Dieses Bild zeigt das Ergebnis eines ersten Vergleichs der Genexpression für neun Gene (gekennzeichnet durch die jeweilige Nummer in jeder Zeile) von P. confluens (P.c.) und S. macrospora (S.m.). Für jedes Gen wurde das Verhältnis der Expression während der Fruchtkörperdifferenzierung im Vergleich zum vegetativen Wachstum mit Hilfe der quantitativen Real-Time-PCR ermittelt. Die Ergebnisse sind als logarithmische Werte angegeben, d.h. positive Werte (rot) zeigen an, dass ein Gen während der Entwicklung heraufreguliert ist, negative Werte (grün), dass es herunterreguliert ist. Werte zwischen -1 und +1 (grau) zeigen an, dass das Gen nicht differentiell exprimiert ist. Von den neun Genen sind drei in beiden Arten heraufreguliert und drei in beiden Arten nicht differentiell exprimiert. Dies zeigt an, dass die Genexpression während der Fruchtkörperentwicklung sogar in diesen beiden nicht sehr nah verwandten Pilzen zu einem hohen Grad konserviert ist.

Links ist das Ergebnis eines ähnlichen Vergleichs gezeigt, diesmal wurden allerdings alle orthologen Gene untersucht, die in den beiden Organismen unter verschiedenen Bedingungen exprimiert werden (mehrere tausend Gene). Auf Grund der großen Zahl der untersuchten Gene sind die Gene nicht mehr einzeln gekennzeichnet. Weiterhin zeigt dieser Vergleich keine Expressionsverhältnisse wie die Abbildung oben, sondern die Zahl der Sequenz-Reads aus RNA-seq-Experimenten. Dieser Vergleich wurde im Rahmen des Pyronema-Genom- und Transkriptom-Projekts durchgeführt, das weiter oben beschrieben wurde. Mehr Details gibt es in der entsprechenden Publikation.

Polyketide biosynthesis cluster

Das Bild zeigt einen solchen Cluster mit der Genomorganisation in S. macrospora (S.m.) und N. crassa (N.c.). Die Gene sind durch Pfeile repräsentiert, die Farbe zeigt an, ob das Gen während der sexuellen Entwicklung hochreguliert ist (rot) oder nicht (schwarz oder grau). Genregionen, die durch graue Schattierung zwischen den beiden Spezies markiert sind, sind ähnlich. Dies zeigt, dass nicht nur die Genexpressionsmuster, sondern auch die Anordnung der Gene im Genom zum größten Teil konserviert ist. Es konnte in einer genaueren Analyse gezeigt werden, dass eines der Gene (2925) an der Fruchtkörperbildung beteiligt ist, da die Deletion dieses Gen zu verzögerter Fruchtkörperreifung führt.

app expression

Dieses Bild zeigt, dass das APP-Protein sowohl in S. macrospora als auch in N. crassa nur in Fruchtkörpern und nicht im umgebenden Myzel angereichert wird. Der obere Teil zeigt die mikroskopische Analyse eines Fusionsproteins, das aus APP und dem grün-fluoreszierenden Protein (GFP) besteht. Das Fusionskonstrukt wurde unter der Kontrolle der regulatorischen Regionen von app exprimiert. Das linke Bild zeigt ein einen jungen Fruchtkörper (Protoperithezium) mit umgebenden Hyphen im differentiellen Interferenzkontrast (DIC). Die grüne GFP-Fluoreszenz kann im jungen Fruchtkörper beobachtet werden, nicht aber in den umgebenden Hyphen. Im unteren Teil ist die Analyse des nativen APP aus N. crassa zu sehen. Proteinextrakte aus Fruchtkörpern und dem umgebenden Myzel (total) sowie aus Fruchtkörpern allein (perithecia) bzw. dem umgebenden Myzel allein (mycelium) wurden nach 10, 12 oder 14 Tagen extrahiert und auf einem denaturierenden Proteingel aufgetrennt. Die APP-Bande ist durch einen Pfeil markiert. APP ist im Gesamtextrakt (total) und in den Fruchtkörpern zu sehen, aber nicht im umgebenden Myzel. Diese und andere Analysen zeigen, dass die Expression von app in S. macrospora und N. crassa sowohl zeitlich als auch räumlich konserviert ist. Eines unserer weiteren Ziele ist es herauszufinden, in welchem Grad die Genexpression während der pilzlichen Entwicklung auf verschiedenen regulatorischen Ebenen konserviert ist.





5. Analyse der Evolution der sexuellen Entwicklung in Tremellomyceten

Das Bild links zeigt ein Modell für die Evolution der Kreuzungstyp-Loci in Tremellomyceten, das auf Basis der vergleichenden Analyse von T. oleaginosus entwickelt wurde. Gene in den Kreuzungstyploci, die zu den Homöodomänen-Transkriptionsfaktoren (HD-Locus) oder den Pheromon- oder Rezeptorgenen (P/R-Locus) gehören, sind in rot bzw. blau dargestellt. Gene, die an der sexuellen Entwicklung beteiligt sind, aber nicht ursprünglich Teil des MAT-Locus waren, sind in grün dargestellt, andere Gene in grau. Es werden nur Gene gezeigt, die in C. neoformans und in der Trichosporon-Linie mit den MAT-Genen (STE3, HD) gekoppelt sind (STE11, STE12, STE20, IKS1, MYO2, RPL22), andere Gene sind der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. Ein Trend zur Integration anderer Entwicklungsgene in die MAT-Loci wird durch die Rekrutierung von STE12 in den P/R-Locus und die anschliessende Rektrutierung des STE11/20-Clusters in den P/R-Locus in der Cryptococcus/Kwoniella/Tremella-Linie deutlich, während diese Gene in der Trichosporon-Linie in den HD-Locus integriert wurden. In Cryptococcus sind fusionierten im Laufe der Evolution die beiden Kreuzungstyp-Loci. Der Verlust eines HD-Gens geschah zweimal unabhängig voneinander in Cryptococcus und Trichosporon. Gennamen sind entsprechend der Benennung in C. neoformans angegeben. Ein putatives Pheromon-Gen (MFA) in der Trichosporon-Linie wird angedeutet, konnte aber bisher nicht eindeutig identifiziert werden. Weitere Details sind in der entsprechenden Publikation in mBio zu finden.