Einführung in die Benutzung der FindPairs Algorithmus
für die quantitative Auswertung von Stable Isotope Labeling Experimenten
- read the english introduction -
Um Peakardt zu starten muss auf der Startseite der Button Launch Peakardt gedrückt werden. Beim ersten Start wir die Anwendung vom Server bezogen und auf die lokale Festplatte kopiert. Bei weiteren Aufrufen wird nur die lokale Version mit der Version auf dem Server verglichen, und nur noch bei Aktualisierungen die Software geladen. Durch die automatische Updateüberprüfung wird immer mir der neuesten Version gearbeitet. Beim ersten Start der Anwendung wird darum gebeten, der Anwendung erweiterte Rechte einzuräumen und "den Inhalten des Urhebers zu vertrauen". Dies ist notwendig, damit z.B. auf die lokale Festplatte zugegriffen werden kann, um Spektrendateien zu öffnen. Ohne die Bestätigung kann Peakardt nicht gestartet werden.
Für die ersten Schritte ist es wichtig zu wissen, dass die Einstellungen über den Menüpunkt Properties|Properties vorgenommen werden.
Da es eine Reihe von einstellbaren Parametern gibt, ist es sinnvoll eine bestehende Konfigurationsdatei zu nutzen, bzw. an die eigenen Bedürfnisse anzupassen. Hier habe ich eine Konfigurationsdatei hinterlegt, wie sie am MPC zur Analyse von ICPL gelabelten Proben auf einer ABI Qstar genutzt wurde. Diese kann dann im Properties-Fenster über das File-Menü geladen werden. Eine Konfigurationsdatei für 15N-Labeling auf der Qstar ist hier zu finden.
Haben Sie ein anderes Massenspektrometer sollten z.B. die Massentoleranzeinstellungen angepasst werden. Es gibt übrigens zwei benutzte Massentoleranzen. Einmal in den Properties unter Filter: diese gibt die Massentoleranz für den Abstand der 13C-Isotopenpeaks an. Dann noch in den Properties unter FindPairs: dieser Eintrag bestimmt die Massentoleranz für den Abstand zwischen den monoisotopischen Peaks des schweren und der leichten Variante eines Peptids.
Wenn das Exportformat ihres Massenspektrometers es zuläßt, können Sie in den Properties unter General auswählen, dass Sie die Peak Area instead of Peak Intensity wünschen.
Wenn Sie Änderungen an den Einstellungen vornehmen können Sie diese dann lokal abspeichern und ebenfalls wieder einladen.
Der nächste Punkt wäre die Wahl der richtigen Labeling-Reagenzien. Unter dem Menüpunkt Properties|Modifications können Sie die bisher aktiv unterstützten Modifikationen sehen. Die ICPL-Reagenzien z.B. sind unter dem Code Namen ICPL_heavy bzw. ICPL_light zu finden. Machen Sie einen Haken in der Spalte Secondary Modification für Ihre Labeling Reagenzien. Falls sie ein anderes Labeling verwenden, welches nicht aufgeführt ist, können Sie mir die für die Tabelle notwendigen Daten einfach zuschicken. Ich trage sie dann in die Liste ein.
Gestartet wird das Quantifizierungsmodul über den Button FindPairs in der ToolBar unter der Menüleiste.
Dort öffnen Sie über das File Menü mittels Open PMF... ihre Spektren. Open PMF recursively... öffnet sämtliche Spektren in allen Unterverzeichnissen.
Unter dem Tab Table sehen Sie die tabellarische Ansicht der Spektren-Peaks. Unter Spectrum dann die Spektrenansicht.
Wichtig ist der Tab Pairs. Hier geben Sie die für ihr quantitatives Experiment wichtigen Daten an:
In das Feld sequence geben Sie die Sequenz des zu untersuchenden Proteins ein, falls bekannt. Notwendig ist hier noch die Angabe des benutzen Verdauenzyms in der Auswahlliste. Achten Sie darauf dass das richtige Labeling-Reagenz in der Modifikationsliste selektiert ist.
Ist die Proteinsequenz nicht bekannt, so genügt es in das Feld shift per peak die Massendifferenz zwischen dem Heavy- und dem Light-Label einzutragen.
Nun können Sie auf den FindPairs-Button drücken und sehen nach kurzer Berechnung für jedes Spektrum die enthalten quantitativen Angaben für alle gefundenen Peptidpaare.
Im Tab Protein werden diese Ergebnisse nochmal zusammengefasst und die Peptid-Intensitäten, falls sie in verschiedenen Spektren gefunden wurden, aufsummiert und ein Gesamtverhältnis bestimmt.
Hat bis hierhin alles geklappt und es wurden Peptidpaare gefunden, können Sie nun die Such-Parameter für Ihre Bedürfnisse und experimentellen Aufbau optimieren. Z.B. könnten Sie den Massenbereich, in dem gesucht werden soll, erhöhen, oder den Wert für die Massentoleranz herabsetzen. Interessant wäre es auch automatisch eventuelle Ausreisser filtern zu lassen.
Im Falle einer Frage genügt eine Email an kai.reidegeld@ruhr-universitaet-bochum.de